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作者：朱启文，张奇
作者单位：沈阳医学院，辽宁沈阳110034；沈阳市铁西区疾控中心理化实验室
vestigation on the Expression of NMDA Receptor Subunit (NR1、NR2A、NR2B) in Different Brain Areas of Plumbum Exposure Rats
N-甲基-D-天门冬氨酸（NmethyD-aspartate，NMDA）受体是离子型谷氨酸（Glutamatic acid）受体的一个亚型，通过对其药理、生理、病理等方面的研究已经证实，NMDA受体在生物发育过程中有着重要的生理作用，可调节神经元的活性，树突、轴突结构的发育及突触可塑性等，在神经元回路的形成及学习和记忆的突触机制中，NMDA受体也起着关键作用[1～4]。正常神经系统的发育需要兴奋性氨基酸受体活性处于最佳水平，如果NMDA受体活性过低则可能使发育延迟，而活性过高又可能导致神经元损伤或脑损伤[5～7]。本研究采用了铅暴露大鼠模型，研究NMDA受体在铅暴露大鼠学习记忆障碍中的变化，探讨其可能的机制。
1 材料与方法
1.1 动物及模型制备40只一月龄SpragueDawley（SD）大鼠由沈阳医学院实验动物中心提供，雌雄不拘，体重（120±15）g，随机分成5组，各8只。铅暴露组分饲0.1%、0.2%、0.5%、1.0%用蒸馏水配制的醋酸铅溶液，对照组给予蒸馏水。3周后娩出子鼠，子鼠21天起断乳，喂以母鼠相同的饮水并单独饲养。当母鼠18个月龄时，采用朱启文等先前报道过的大鼠多功能行为训练装置[8]，在术前及术后14d开始被动回避反应（passive avoidance response，PAR）训练。将铅暴露大鼠模型合格者处死取脑标本进行下列实验。
1.2 方法
1.2.1 Western Blot 分析 （1）试剂：NR1、NR2A多克隆抗体购于santa cruz公司；NR2B购于博士德生物工程有限公司；辣根过氧化物酶标记兔抗羊和羊抗兔抗体购于中山公司。（2）样品处理：取大鼠不同脑区标本，切取一部分，裂解脑组织提取总蛋白。上样，电泳，湿转至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭。将PVDF膜在置于4℃NMDA受体杂交液（1：500）中摇床过夜，然后在过氧化物酶标记二抗（IgG）杂交液（1：5000）中孵育1h。最后ECL发光显影。
1.2.2 组织总RNA的提取及RTPCR（1）试剂：RNeasy Mini Kit试剂盒购于QIAGEN公司。RTPCR试剂盒购于Takara公司。（2）样品处理：按试剂盒步骤提取总RNA，紫外分光光度计测定，计算总RNA的浓度。反转录后以βactin为内参进行扩增。PCR扩增片断长度为：NR1463bp，NR2A421bp，NR2B651bp，βactin445bp。取PCR产物经1.2%的琼脂糖凝胶电泳后染色，成像。
1.3 统计学分析采用t检验进行统计学处理。
2 结果
2.1 Western Blot结果铅暴露大鼠海马区NR1、NR2A、NR2B亚基蛋白表达明显减弱，额叶皮质和纹状体次之，经统计学处理差异有显著性（P＜0.05），新小脑区无明显减弱（P＜0.5）（图1～3）。
2.2 RTPCR检测结果正常对照组大鼠NR1、NR2A亚基mRNA表达新小脑较强（P＜0.05），其余各区无差异，NR2B亚基mRNA额叶皮质及新小脑表达较强（P＜0.05）。铅暴露大鼠组三种亚基的mRNA表达均有不同程度的下调。铅暴露大鼠中各区NR1亚基mRNA表达均有所降低，其下调趋势趋于一致（P＜0.05）（图4）；NR2A亚基mRNA在铅暴露大鼠中额叶皮质、新小脑区、海马及纹状体的表达下调趋势均很明显（P＜0.05）（图5）；NR2B亚基在额叶皮质、新小脑区的表达趋势下降最显著，纹状体次之（P＜0.05），海马最次之（图6）。
3 讨论
兴奋性氨基酸（EAA）受体有三种亚型：海人草酸（KA）受体，使君子氨酸（QA）受体和N-甲基-D-天门冬氨酸（NMDA）受体。NMDA受体通道只在学习记忆过程中才开启，因此被认为是学习记忆中的关键物质。NMDA受体不仅调节Na+、K+通道，还控制Ca2+通道。当被激活时，有跨膜Na+K+流动，也有大量Ca2+流入胞内。Ca2+可作为第二信使，可能直接或间接使膜受体发生改变，从而改变突触效率，产生记忆[9]。
Martin等报道，利用Western Blott方法证实16位AD患者死后大脑四个不同脑区NR1，NR2A和NR2B蛋白磷酸化水平与患者死前认知反应行为测试正相关，且NR1和NR2B在海马减少，在枕叶及尾核却未见减少[10,11]。
图1 铅暴露大鼠和正常对照大鼠NR1亚基Westernblot检测结果（略）
图2 铅暴露大鼠和正常对照大鼠NR2A亚基Western blot检测结果（略）
图3 铅暴露大鼠和正常对照大鼠NR2B亚基Western blot检测结果（略）
图4铅暴露大鼠和正常对照大鼠NR1亚基RTPCR检测结果（略）
图5 铅暴露大鼠和正常对照大鼠NR2A亚基RTPCR检测结果（略）
图6 铅暴露大鼠和正常对照大鼠NR2B亚基RTPCR检测结果（略）
Sze等报道，采用RTPCR技术证实9位AD患者死后大脑中NR2A和NR2B亚基mRNA的水平在海马和内嗅皮质中是降低的，NR1亚基的mRNA水平在受试者的三个脑区中是相似的，在小脑，三种亚基的mRNA水平却未见减少，且这种变化是与年龄和死后延搁无关[12]。
本实验研究结果表明，NR1，NR2A和NR2B的蛋白水平和mRNA水平在铅暴露大鼠的额叶皮质、海马、新小脑和纹状体中均是降低的。表明在铅暴露大鼠中，NMDA受体亚基NR1，NR2A和NR2B的表达在mRNA水平就已经发生了改变，为进一步研究降低的NR1,NR2A和NR2B亚基水平和学习和记忆能力降低之间的联系，探索NMDA受体亚基在学习和记忆中的作用，提供了理论依据。
【参考文献】
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