作者：贺智，李积胜，王大宁，刁秋霞，何瑞波
作者单位：武警医学院军事预防医学研究所，天津 300162
【摘要】
目的 了解海马各区Bcl2阳性细胞在铅神经毒机制中的作用。方法 采用免疫组化（ABC）法观察腹腔注射130mg/kg醋酸铅溶液大鼠12和24h后海马CA1区和CA3区Bcl2阳性细胞数目的变化。结果 染铅12和24h大鼠海马CA1区Bcl2阳性细胞数目（分别为126.05±33.21和(57.45±37.66）与对照组比较（201.94±31.72）明显减少（P>0.05,或P<0.01），但各组大鼠海马CA3区及其他组的CA1区Bcl2阳性细胞数与对照组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。结论 染铅大鼠海马CA1区Bcl2阳性细胞数目减少可能与铅的神经毒作用有关。
【关键词】 铅
有文献报道，铅的神经毒性可能和脑细胞凋亡有关〔1，2〕。近年来研究表明，海马结构各亚区的Bcl2基因表达异常可能是铅触发海马神经细胞凋亡发生的主要介导因素〔3〕。目前发现，Bcl2（B cell lymhona/leuRenia2)基因在细胞凋亡调控过程中起着重要作用，Bcl2蛋白不仅具有抗淋巴细胞凋亡作用，也具有抗神经细胞凋亡的作用〔3〕。张荣〔4〕等采用流式细胞仪研究发现，染铅与脑细胞发生凋亡率有剂量反应关系，与Bcl2含量呈现负相关。但染铅对海马不同亚区Bcl2蛋白表达的影响，目前尚不清楚。本研究采用免疫组化法观察染铅不同时点大鼠海马CA1区和CA3区Bcl2阳性细胞数目的动态变化，以了解铅对海马各区细胞的影响。
1 材料与方法
1.1 实验动物及处理 选用刚断乳健康Wistar大鼠30只，雌雄各半(天津市劳动卫生研究所)。自由饮水、普通饲料适应性喂养3d。随机分为对照组和染铅3，6，12和24h组共5组，每组6只（雌雄各半），一次性腹腔注射进行染毒：（1）染铅组：130mg/（kg·bw）的醋酸铅水溶液；（2）对照组：等体积09% NaCl。
1.2 实验方法
1.2.1 取材和切片 染铅组大鼠分别于染毒3，6，12，24h结束时腹腔注射戊巴比妥钠（60mg/kg）麻醉，开胸，夹闭腹主动脉，经左心室插管，用37℃生理盐水100～150ml快速冲洗后，以含4%多聚甲醛的磷酸盐缓冲液（PBS）（01mol/L,pH74)灌注固定，迅速取脑后，置多聚甲醛中继续固定7～9h（4℃），移入20%蔗糖溶液浸泡12h以上。恒冷箱连续冰冻切片（片厚为50μm),进行Bcl2免疫组化反应。
1.2.2 Bcl2免疫组化反应 切片移入37℃ TritonH2O2中反应30min,PBS缓冲液漂洗后以3%正常羊血清封闭30min，然后加Bcl2一抗（1：200），4℃温盒内孵育72h后，免疫组化法（ABC）显色，常规裱片，脱水，透明，封片。
1.2.3 结果判断 Bcl2阳性细胞显棕色或棕色反应颗粒，不显色为阴性反应；以Bcl2阳性的癫痫大鼠海马切片为阳性对照，以正常羊血清代替Bcl2一抗作为对照，结果为阴性反应；以01mol/LPBS(pH 74)代替Bcl2一抗为空白对照，结果为阴性反应。
1.2.4 Bcl2阳性细胞计数 每组选取对应断面的海马脑片15张（每只动物取2～3张），采用尺型计数器在相同放大倍数（×200）的光镜下，分别计数CA1和CA3区每毫米的阳性细胞数。
1.3 统计分析 采用SPSS80软件进行分析。
2 结果
2.1 不同染铅时间海马区光镜下观察结果 光镜下，海马结构各区存在Bcl2反应阳性神经元；染铅3h时，海马各亚区均无明显变化；染铅6h时，海马CA1和CA3区Bcl2阳性细胞显色稍加深，阳性细胞数有所增加；染铅12h时，海马CA1区阳性细胞显色明显变浅，阳性细胞数明显减少，而CA3区未见明显变化；染铅24h，海马CA1区与12h比较Bc12阳性细胞显色加深，阳性细胞数渐增多，但较对照组的阳性细胞数少，显色强度弱，而CA3区未见明显变化。
2.2 不同染铅时间海马区阳性细胞数组间比较(表1)
表1 不同染铅时间大鼠海马各区Bcl2阳性细胞数比较（略）
注：与对照组比较，* P<005,** P<001;脑片数=15
3 讨论
有报道〔2，4〕，染铅大鼠大脑皮层、海马和小脑细胞凋亡率均明显高于对照组，Bcl2蛋白是一种神经保护蛋白，其抗凋亡作用与其抗氧化作用有关〔5〕。张荣等发现，大鼠染铅5d后,皮层、海马和小脑Bcl2基因表达下降，Bcl2含量与染铅剂量呈相关〔4〕。鉴于细胞凋亡对于胚胎发育、维持细胞总体数量等过程都具有重要作用，所以脑细胞的凋亡必然会对中枢神经的结构和功能造成损伤。铅对于海马不同亚区神经元的代谢及功能如LTP的影响不同〔6〕，推测铅对海马不同亚区Bcl2阳性细胞的影响可能不同。进一步研究染铅对海马不同亚区Bcl2蛋白表达的影响，将对深入了解铅干扰学习记忆机制提供重要依据。本研究于大鼠染铅12h后，观察到海马CAl区Bcl2阳性细胞数目明显减少(P<001),24h时仍处于较低水平(P<005),而在不同时间染铅组与对照组间海马CA3区Bcl2阳性细胞数差异已无统计学意义(P>005)。铅的神经毒性作用尤其是对学习记忆影响的机制相当复杂，铅对海马不同亚区Bcl2蛋白表达的不同影响仅仅是其分子机制的一个环节，完全阐明铅神经毒性，尤其是对学习记忆影响的机制尚需深入研究，但铅对海马不同亚区Bcl2蛋白表达的不同影响说明其作用机制与海马CAl区细胞凋亡保护基因的蛋白表达水平下调有关。
【参考文献】
〔1〕 Savolainen KM,Eerikainon S.Interaction of excitatory neruotransmitters and denobiotics in excitotoxicity and oxidative stress［J］.Glutamate and Lead Toxicol Lett,1998,102:363-367.
〔2〕 Oberto A,Marks N,Evans HZ,et al.Lead(Pb2+)promates apoptosis in newborn rat cerebral neurons:pathological implications［J］.J Pharmacol Exp Ther,1996,279(1):435-442.
〔3〕 Hockenbery D,Nunez G,Milliman C,et al.Bcl2 is an inner mitochondrial membrane protein that blocks programmed cell death［J］.Nature,1990,348(6299):334-336.
〔4〕 张荣，牛玉杰，程云会，等.醋酸铅对大鼠脑细胞凋亡及bcl2基因表达的影响［J］.中华劳动卫生与职业病杂志，2000，18(4):232-234.
〔5〕 Vaux DL.Toward an understaning of the molecular mechanisms of physiologcal cell death［J］.Proc Natl Acad Sci USA,1993,90(3):786-791.
〔6〕 王静，李积胜，张进，等.铅对大鼠海马一氧化氮合酶活力表达的影响［J］.中华劳动卫生职业病杂志，2000,18(4):204-206.
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