摘　要：目的　探讨铅的胚胎神经细胞发育毒性与谷胱甘肽水平的关系。方法　应用大鼠中脑神经细胞微团培养法检测铅对胚胎神经细胞存活、分化和谷胱甘肽含量的影响。结果　铅的细胞存活半数抑制浓度为3.69 μmol/L，半数分化抑制浓度为1.03 μmol/L，均呈现明显的剂量-效应关系，铅可使细胞内谷胱甘肽含量下降。N-乙酰半胱氨酸可不同程度地增加细胞的存活和分化率，并提高谷胱甘肽水平。结论　铅是神经细胞分化的特异抑制剂，其脑细胞发育毒性与谷胱甘肽含量下降所致的氧化还原失衡有关。
　　关键词：铅中毒；脑；神经元；谷胱甘肽
　　Toxicity to neural cell development of lead and its relation to glutathione
　　LI Hong, FU Shaolian. 　　Department of Maternal and Child Health, Beijing Medical University, Beijing 100083, China
　　Abstract：Objective　To investigate the toxicity of lead to embryonic neural cell development and its relation to glutathione level. Methods　Rat midbrain micromass culture method was used to observe effects of lead on viability, differentiation and glutathione (GSH) content of embryonic neural cells. Results　Lead concentrations at 3.69 μmol/L and 1.03 μmol/L could inhibit neural cell variability and differentiation by 50%, respectively, both in a significant dose-response pattern. Lead also could cause increase level of glutathione. N-acetylcysteine (NAC), an antioxidant, could not only reduce adverse effect of lead on GSH, but also antagonize its toxicity to cell survival and differentiation. Conclusion　Lead can specifically inhibit neural cell differentiation and its neurotoxic effects on brain cell development correlated to imbalance in redox status which is mainly mediated by decrease of GSH content.
　　Key words：Lead poisoning；Brain；Neurons；Glutathione
　　中枢神经系统是铅毒性作用的重要靶器官。铅的神经毒性与其氧化作用有关，铅能抑制体外培养的神经元细胞的分化。然而，铅抑制神经元分化的作用是否与其氧化作用有关，尚未见报道。本研究探讨了铅对神经细胞存活分化及氧化还原状态的影响，并初步研究二者的相关性及抗氧化剂对铅毒性的拮抗作用，为铅毒性的防护提供依据。
材料与方法
　　1.主要试剂：醋酸铅(Fluka公司)，F12培养基(美国Gibco公司)，新生牛血清(Gibco公司)，马血清(Gibco公司)，胰蛋白酶(1:250，Gibco公司)，噻唑蓝(MTT，Sigma公司)，考马斯亮蓝(Fluka公司)，还原型谷胱甘肽(GSH，Sigma公司)，其他试剂均为国产分析纯。
　　2.主要仪器：NapCO自动水套式CO2培养箱(美国)，Olympus实体解剖显微镜(日本)，XSZ-D2型倒置生物显微镜(重庆光学仪器厂)，DG-3022A型酶联免疫检测仪(华东电子管厂)。
　　3.实验动物：由北京医科大学实验动物中心提供成年SD大鼠，体重200～250 g，雌雄1∶1合笼，次日清晨检查阴栓，见栓之日定为妊娠0 d。
　　4.大鼠胚胎中脑神经细胞的制备：采用Flint中脑微团培养法［1］，颈椎脱臼法处死妊娠13 d的SD孕鼠，取出子宫，剥离全部胚胎(34～36个体节)，切取中脑，置于0.5％胰蛋白酶/PBS消化液中，37℃孵育约25 min。吸弃消化液，再加入完全培养液，用吸管吹打使之成为细胞悬液后，调整细胞密度为5×106/ml。培养当天计为0 d，此后依次为1～5 d。
　　5.细胞毒性实验：96孔培养板每孔接种10 μl细胞悬液，置CO2培养箱中(5％CO2/95％空气，100％相对湿度)孵育2.5 h，待细胞贴壁后每孔加200 μl完全培养液继续培养1 d，换含不同浓度醋酸铅的新鲜培养液200 μl染毒4 d。利用MTT法检测细胞存活情况［2］。
　　6.细胞分化试验［2］：24孔培养板每孔接种20 μl细胞悬液，置CO2培养箱中孵育2.5 h以使细胞贴壁，然后每孔加1 ml完全培养液继续培养1 d后，换含不同浓度醋酸铅的培养液染毒，4 d后进行苏木精染色。在实体显微镜下计数集落。
　　7.细胞内谷胱甘肽(GSH)含量检测及N-乙酰半胱氨酸(NAC)的拮抗实验：细胞接种于24孔板，分别作4种处理：①对照组，②醋酸铅染毒组，③NAC单独处理组，④醋酸铅+NAC处理组。首先，②、④组加入含不同剂量醋酸铅的培养液染毒，1 d后终止，用PBS洗3遍。然后，③、④组换含1 mmol/L NAC的培养液，①、②组则换空白培养液继续培养。于培养2和5 d，用细胞刮刮取细胞，离心去上清，于磷酸钠-EDTA偏磷酸缓冲液中超声粉碎细胞，用荧光法分别检测细胞的GSH含量［3］，同时用考马斯亮蓝法检测各组细胞的蛋白含量［4］。GSH含量以nmol/mg蛋白表示。第5天同时检测各组的细胞毒性及分化情况。
　　8.统计分析方法：用SAS软件对数据进行细胞存活半数抑制浓度和半数分化抑制浓度分析。用SPSS软件进行t检验、多因素方差分析和相关分析。
结果
　　1.铅对细胞存活和分化的影响（表1）：不同浓度的醋酸铅染毒后，均可抑制细胞的存活，且有明显的剂量-效应关系(r=-0.86, P＜0.05)，其细胞存活半数抑制浓度为3.69 μmol/L，95％可信区间为2.00～7.06 μmol/L。不同浓度的醋酸铅染毒4 d后，均可抑制细胞的分化，并呈现明显的剂量-效应关系（r=-0.920 4，P＜0.01），半数分化抑制浓度为1.03 μmol/L，95％可信区间为0.90～1.18 μmol/L。
　　2.铅对神经细胞内GSH含量的影响及NAC的拮抗作用（表2～4）：1 mmol/L NAC本身可促进细胞的增殖，并可明显提高各剂量组细胞的存活率，与单加醋酸铅组相比差异有显著性。NAC本身对细胞的分化无明显影响，但可明显增加各剂量组的分化率，与单加醋酸铅组相比差异有显著性，相比之下分化率较存活率增加的更明显。
讨论
　　本研究显示，铅对中脑神经细胞的存活和分化均有明显的抑制作用，而抑制分化所需浓度较低，其细胞存活半数抑制浓度与分化半数抑制浓度的比值为3.58，表明铅的分化毒性并非完全由细胞毒性引起，铅是神经细胞分化的特异抑制剂，并可能具有致畸性。由于神经元一旦分化产生便不再分裂，不具备自我更新的能力，因而其正常分化过程的受损即可能导致神经系统功能下降，表明铅的脑发育毒性可能与其抑制神经元的分化，从而影响脑的正常功能建立有关。
　　细胞分化是基因调控的结果，同时亦受多种环境因素的调节和影响，其中细胞的氧化还原状态对细胞分化起着不可忽视的作用。GSH是细胞中含量相当高的一种抗氧化剂，其微小变化就可能影响细胞的氧化还原平衡［5］。本研究显示，铅可导致细胞内GSH的水平下降，使细胞的氧化还原失衡，且其作用随染毒剂量的加大和培养时间的延长而加强，这与以往的报道基本一致［6］。而染毒后再用NAC孵育细胞，GSH含量较未用NAC处理组明显增高。同时发现，NAC可抑制铅的细胞存活和分化毒性，对分化毒性的拮抗作用更强。由于NAC是一种作用很强的抗氧化剂，很容易通过细胞膜，并在细胞内代谢转化为GSH［5］。因此，本研究结果表明，铅对细胞的存活和分化的影响与其引起的GSH含量下降有关，而提高细胞内GSH水平可抑制其毒性作用。
　　志谢　沈惠麒、王洪玮教授，罗扬、王起恩、贾光博士，胡江、张敬旭、赵京辉、许君辉等同志
作者单位：李宏(100083 北京医科大学公共卫生学院妇幼卫生学系) 符绍莲(100083 北京医科大学公共卫生学院妇幼卫生学系)
参考文献
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［2］Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. J Immunol Methods, 1983， 65: 55-63.
［3］沈惠麒，赵利英，曲青山. 组织中谷胱甘肽的荧光测定法. 中华劳动卫生职业病杂志，1988，6: 103-108.
［4］Walum E, Flint OP. Midbrain micromass culture: a model for studies of teratogenic and sub-teratogenic effects on CNS development. Acta Physiol Scand Suppl, 1990, 592: 61-72.
［5］Allen RG. Oxygen-reactive species and antioxidant responses during development： the metabolic paradox of cellular differentiation. Proc Soc Exp Biol Med, 1991,196：117-129.
［6］Ercal N, Treeratphan P, Hammond TC, et al. In vivo indices of oxidative stress in lead-exposed C57BL/6 mice are reduced by treatment with meso-2,3-dimercaptosuccinic acid or N-acetylcysteine. Free Radic Biol Med, 1996，21：157-161.