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【摘要】 目的 探讨铅对小鼠海马磷酸化环磷酯腺苷(cAMP)反应成分结合蛋白(pCREB)表达的影响。方法 小鼠出生第1d起染铅组母鼠开始通过饮水饲以24，48，96mmol/L浓度醋酸铅。幼鼠出生后，先通过哺乳接触铅，断乳后则自行饮用与母鼠饮用浓度相同的含铅水。分别在14，28，42，56d处死小鼠，用蛋白免疫印记法观察各组小鼠海马区pCREB蛋白表达状况。结果 慢性铅暴露小鼠脑海马pCREB蛋白的表达总体上呈现下降趋势，与对照组比较，24mmol/L铅暴露使14d小鼠pCREB蛋白表达升高，但差异无统计学意义(P＞005)；而48，96mmol/L铅暴露组pCREB蛋白表达一直维持在较低的水平，差异有统计学意义(P＜005)。结论 铅扰乱pCREB蛋白正常表达。
【关键词】 铅
铅是工业应用最广泛的重金属之一，在自然界中广泛存在，居住环境中的生活性铅污染严重危害着人类的健康，尤其是儿童铅中毒流行比率远远高于成人，明显影响儿童的智力发育。本研究旨在通过观察慢性醋酸铅染毒小鼠海马磷酸化环磷酸腺苷(cAMP)反应成分结合蛋白(pCREB)表达的影响来探讨慢性铅中毒分子机制。
1 材料与方法
1.1 材料 昆明系小白鼠(中国医科大学实验动物部)，雌雄2∶1，体重28～34g。分析纯醋酸铅和硝酸纤维素膜(中国实验原平皓公司)。十二烷基硫酸钠(SDS)(华美生物技术公司)。牛血清白蛋白(联星生物工程公司)。pCREB-抗(美国Cell Signaling公司)。辣根过氧化物酶(HPR)标记的驴抗兔标记的第二抗体(北京中山生物技术有限公司)。低温离心机F218型(美国Sigma公司)。
1.2 方法 (1)染毒方法及剂量：按每笼雄∶雌为1∶2自然交配。将受孕母鼠所生小鼠随机分为4组，每组10只，共40只；对照组和24，48，96mmol/L染铅组。从小鼠出生第1d起染铅组母鼠开始通过饮水饲以不同浓度(24，48，96mmol/L)醋酸铅水溶液。对照组母鼠饮用自来水。为确保相同的营养条件，每个母鼠最多喂养10只胎鼠。断乳后幼鼠开始自己饮用与其母鼠相同的饮用水。于出生后第14，28，42，56d解剖小鼠取出脑海马，放入液氮中，转存到-70℃冰箱中。(2)蛋白免疫印记法：将收集的样品放到4℃预冷的裂解缓冲液中，4℃超声混匀(6s，6次)，4℃震荡60min，离心25000g，60min，取上清分装。用酚试剂法测蛋白，以牛血清蛋白为标准品。用10%的十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)分离蛋白质，每孔蛋白加样量为40μg。常规蛋白免疫印迹法测定pCREB含量。将蛋白印迹显影图扫描，再应用Chemi Imager 5500 V203图像分析软件对结果进行分析。灰度值代表酶含量，以不同天数对照组的灰度值为100，其余各组与相应天数的对照组比较。
1.3 统计分析 采用SPSS 110软件进行单因素方差分析。
2 结果
2.1 慢性铅暴露对小鼠血铅和脑海马铅含量的影响 于小鼠出生后42d对血铅和脑海马铅含量进行测定，各慢性染铅组小鼠血铅和脑海马铅含量均明显高于对照组，差异有统计学意义(P＜001)，升高的程度与饮用水的铅浓度呈正相关，见表1。
表1 小鼠血铅、海马铅浓度（略）
注：与对照组比较，a P＜001；与同时期24mmol/L组比较，b P＜001；与同时期48mmol/L组比较，c P＜001
2.2 蛋白免疫印迹检测pCREB结果 本实验所用的一抗具有特异识别CREB的磷酸化Ser133特性，所以实验的灰度值代表pCREB。将实验后的电泳图扫描后，以不同天数对照组的灰度值为100，其余各组与同时期天数的对照组比较。结果发现，除14d低剂量组外，差异均有统计学意义(P＜001)。低剂量组铅暴露对小鼠pCREB蛋白表达42d前呈现下降趋势，且只有14d低剂量组略高于对照组。中剂量组鼠pCREB蛋白表达与同时期低剂量组比较只有14d差异有统计学意义(P＜001)。高剂量组鼠pCREB蛋白表达与同时期低剂量组相比较只有14，56d差异有统计学意义(P＜001)。各组pCREB蛋白表达与其自身14d比较差异无统计学意义。中、高剂量组分别在14和42d达谷底，分别下降了4294%和4221%，见表2，图1。
表2 慢性铅中毒对pCREB蛋白表达的影响（略）
注：与同时期的对照组比较，a P＜001；与同时期24mmol/L组比较，b P＜001
图1 Western Blots检测pCREB结果（略）
3 讨论
从无脊椎动物到哺乳类动物，在长时程记忆的编码方面有共同的分子机制，其中转录因子cANP反应元件结合蛋白性氨基酸亮氨酸拉链转录因子家庭，它有2种形式：具有(CREB)在长时记忆过程中起着关键性的作用〔1〕。CREB属于碱转录活性的二聚体和无转录活性的单体。其133位的丝氨酸残基(Ser133)可被蛋白激酶A(PKA)或钙/钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)等磷酸化，磷酸化后的CREB(pCREB)形成同源二聚体或与CREB/ATF(激活转录因子1)家庭的其他成员形成异二聚体，使CREB活化，与cAPM的应元件(CRE)结合，调控靶基因(如cfos,cjun等)的转录〔2〕。本实验结果显示，除14d低剂量组外，各组pCREB均比同时期的对照组低，其他时间点都随铅浓度的增加而降低，与我们以前实验的CaMKⅡ蛋白表达变化规律相似〔3〕，表明其都具有铅的浓度依赖性降低。根据结果推测，铅通过抑制海马N甲基D天冬氨酸(NMDA)等钙离子通道及其受体，影响胞内钙离子稳态失衡和CaMKⅡ和N甲基D天冬氨酸受体(NMDAR)的正常结合〔4〕，抑制腺苷酸环化酶〔5〕，影响CaMKⅡ、PKA等的激活状态，干扰pCREB蛋白活性，cfos，jun基因表达和新蛋白质的合成，导致影响正常的学习记忆功能〔6〕。
【参考文献】
〔1〕 Frank DA,Greenberg ME.CREB:A mediaton of longterm memory from mollusks to mammals［J］.Cell,1994,79:5-8.
〔2〕 Pietruck C,Xie GX,Sharma M,et al.Multiple splice patterns of cyclic AMP response elementbinding protein mRNA in the central nervous system of the rat［J］.Brain Res Mol Brain Res,1999,69(2):286-289.
〔3〕 文涛，孙黎光，宗志宏，等.慢性铅暴露对小鼠CaMKⅡ蛋白表达的影响［J］.中国公共卫生，2006，22(10)：1211-1212.
〔4〕 高明奇，孙黎光，周彬，等.慢性铅暴露小鼠海马NMDAR亚单位基因表达［J］.中国公共卫生，2006，22(5)：574-575.
〔5〕 阮迪云.铅对儿童学习记忆的影响及其细胞和分子机理［J］.中国药理学与毒理学杂志，1997，11(2)：97-98.
〔6〕 文涛，孙黎光，宗志宏，等.铅对小鼠海马区cjun表达及学习记忆功能的影响［J］.中国公共卫生，2005，21(2)：183-184.
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