【关键词】  铅 补钙 哺乳期 学习记忆
　　国内外研究〔1〕报道，宫内铅暴露对出生后儿童的认知能力、学习记忆能力及神经系统发育均有一定的不良影响，一些发达国家视儿童铅中毒为首要的儿童环境健康问题。很多学者〔2〕致力于儿童铅中毒的预防及干预研究，他们认为预防铅中毒，除了环境干预，如推广无铅汽油，杜绝使用含铅制品包装或存放食物，营养因素在预防中的作用也不容忽视。赵微等〔3〕曾报道补钙对中度铅中毒(血铅200～449 μg／L)的儿童有显著的治疗作用。本文对孕哺期铅染毒对仔鼠学习记忆能力的影响及其与钙的相互作用进行了研究，并通过观察海马组织中精氨酸加压素(AVP)表达的改变，探讨钙对铅污染的预防机制。
　　1  材料与方法
　　1.1  主要仪器和试剂  CHYZ-F-GS显微镜(日本Olympus公司)；YBL-2生物组织包埋机(瑞典Ohauscorporatior公司)，HM-315组织切片机(德国Walldorf公司)；HMP-100组织脱水机和YT-6生物组织摊烤机(孝感亚光医用电子技术研究所)。兔抗大鼠AVP多克隆抗体(丹麦DAKO公司)。
　　1.2  制备动物模型  成年SD大鼠(军事医学科学院)，分笼饲养7 d后，按雌雄比2：1合笼，以次日凌晨在排泄物托盘中发现阴栓或阴道分泌物镜检发现精子者定为已受孕，并记为妊娠0 d，随机选取24只受孕鼠，体重200～220 g，分为4组。从受孕第0 d起一直到仔鼠生后第30 d给予不同受试物：(1)对照组：饮去离子水；(2)实验l组：饮0.05％醋酸铅水；(3)实验2组：饮0.1％醋酸铅水；(4)0.1％铅+钙组：饮用浓度为0.1％醋酸铅去离子水，同时每天灌胃250 mg／kg钙。每组随机选取24只仔鼠，其中12只仔鼠用于进行Y-迷宫试验。另外12只经水合氯醛(0.35ml／100 mg)腹腔麻醉后开胸，左心室插入灌注针，剪破右心耳，之后快速依次灌注生理盐水100～150 ml，4℃的4％多聚甲醛250 ml于30～40 min灌毕。迅速取脑置4℃的同样固定液中后固定7～9 h后移入20％蔗糖浸泡12 h以上。恒冷箱冰冻切片(50 μm)，pH 7.4的0.01 mol／L磷酸盐缓冲液(PBS)接片。
　　1.3  Y-迷宫试验  仔鼠哺育至30 d后进行Y一迷宫试验。整个实验规定仔鼠受电击后从起始臂直接逃至安全臂为正确反应,先进入通电臂则为错误反应，并记录为1次错误。以动物错误的次数(Total error，TE)作为评价仔鼠学习记忆能力的指标。通电给予足部最小电刺激，初始刺激电压为15 V，如果没有反应，以5V为间隔单位上调刺激强度直至仔鼠有反应。
　　1.4  精氨酸加压素(AVP)免疫组织化学染色  组织切片脱蜡，酒精梯度脱水，以PBS洗5 min共3次，3％正常羊血清封闭30 min，消除内源性过氧化物酶，再以PBS洗5 min共3次，抗原修复，10％生物素化羊抗兔IgG37 ℃孵育30 min后滴加特异性一抗，4℃过夜。PBS洗5 min共3次。滴加1：100稀释的生物素化二抗，37 ℃孵育30 min以后以PBS洗5 min共3次。滴加过氧化物酶标记的链霉亲和素，37℃孵育30 min，二氨基联苯胺(DAB)显色10 min，封片。
　　1.5  统计分析  采用Sigmastat统计软件进行分析，2组间比较用t检验，多组间比较采用单因素方差分析及Dunnett's检验。
　　2  结果
　　2.1  Y-迷宫实验结果  对照组仔鼠迷宫错误次数明显低于染铅组，差异有统计学意义(P<0.05，P<0.01)；0.1％铅+钙组迷宫错误次数明显低于0.1％染铅组，差异有统计学意义(P<0.05)。
　　2.2  各组海马AVP阳性神经元数目的变化(表1)  每组选取对应断面的海马脑片24张，分别计数CA1、CA3区内4个视野的AVP经元数目，并观察其形态。0.05％染铅组与对照组比较CA1区AVP阳性神经元数目减少，差异有统计学意义(P<0.05)；0.1％染铅组与对照组比较CA1区及CA3区AVP阳性神经元数目均明显减少，差异有统计学意义(P<0.01)；0.1％铅+钙组与0.1％染铅组比较CA1区及CA3区AVP阳性神经元数目均明显增多，差异有统计学意义(P<0.05)；铅污染海马神经细胞形态变得不规则，排列松散，AVP阳性物质着色淡。
　　表1  AVP阳性神经元数目（略）
　　注：与正常对照组比较，a P<0.05，b P<0.01；与0.1％染铅组比较，c P<0.05。
　　3  讨论   
　　研究发现，随染铅浓度升高，子代迷宫错误次数增多，海马AVP阳性神经元数目减少，尤其是海马CA1区，表明孕哺期的铅污染直接影响了其子代的学习记忆能力，并导致了以海马CA1区最敏感的AVP的减少。染铅同时补充钙剂，虽铅浓度相同，但动物学习记忆能力明显改善，海马CA1、CA3区AVP显著增高，提示钙在一定程度上有拮抗铅的神经毒性作用，并在分子生物学水平得到验证。铅和钙同为二价金属阳离子，在机体内有类似的代谢过程〔4〕，钙能通过与铅竞争肠道结合蛋白上的共同结合位点，抑制铅的吸收，所以可以考虑通过补钙的方法达到驱铅的目的。孕哺期慢性铅暴露已经可以对子代神经系统产生明显的影响，降低智商，且儿童对铅的毒性作用比成年人敏感，铅排泄也极为缓慢，即使环境铅浓度降至较低水平，长期慢性铅吸收所引起的积累性毒害也不可避免。本研究为探求铅暴露儿童早期干预的有效手段提供参考依据。  
　　研究中的不足之处是只考虑了钙剂的作用而未对微量元素如锌、铁等进行同步研究。由于钙在胃肠道吸收的绝对量远大于锌、铁等，估计微量元素的作用可能被掩盖而可以忽略不计。
    【参考文献】
　　〔1〕 Carrington CD.Hazard assessment of lead［J］.Food Addit Contam,1993,10:325-335.
　　〔2〕 戚其平，杨艳伟，姚孝元，等.中国城镇儿童血铅水平的研究［J］.中华流行病学杂志，2002，23(3)：162-166.
　　〔3〕 ZHAO W,Markowitz M,Clement I,et al.The therapeutic effects of calcium supplement for mild lead poison on children［J］.Chinese Journal of Pediatries,1998,36(3):146-148.
　　〔4〕 LEI J.Damage to brain development by lead ［J］.Foreign Medical Sciences,2002,13(1):33-34.