【摘要】 目的 研究铅暴露大鼠海马神经细胞精氨酸加压素（AVP）、生长抑素（SS）的阳性表达，及其与学习记忆障碍的关系。方法 将健康两月龄SD大鼠60只，随机分为对照组、染铅组，每组30只，染铅动物饮用0.1%醋酸铅去离子水3个月，制成慢性染铅大鼠模型；对照组饮用去离子水。Y迷宫试验检测两组大鼠的学习和记忆能力，采用免疫组化方法测定大鼠海马AVP和SS阳性神经元数，观察铅暴露对其阳性表达的影响。结果 染铅组大鼠学习记忆能力较对照组明显减低（P<0.01），海马CA1区AVP 和SS阳性神经元数量均明显减少（均P<0.01），CA3区AVP（P<0.05）和SS（P>0.05）阳性神经元数量亦减少，但不如CA1区明显。结论 铅暴露大鼠学习记忆能力的减低可能与海马神经细胞AVP和SS的阳性表达减少有关。
【关键词】 铅暴露 精氨酸加压素 生长抑素
Study of relative mechanism of the disorder of learning and memory in lead exposure rats WEI Ci, WANG Shusong, L Peiyuan, et al. Department of Neurology, Hebei General Hospital, Shijiazhuang 050051, China
Abstract：Objective To investigate the relationship between the disorder of learning and memory in lead rats and the argnine vasopressin (AVP) and the somatotatin (SS) of hippocampus.Methods Sixty healthy 2month old SpragueDawley rats were randomly divided into normal control group and lead group. Normal control group was given deionized water and the lead group was given 0.1% lead acetate deionized water for 3 months to make chronic lead rat. Learning and memory ability was tested by the Ymaze test. The content of AVP and SS in hippocampus were tested by the immunohistochemical method. Results The learning memory ability and the content of AVP and SS in hippocampus CA1 section of the lead group were degraded obviously than the control group（all P<0.01）. The content of AVP（P<0.05）and SS（P>0.05）in hippocampus CA3 section of the lead group were degraded also.Conclusion The disorder of the learning and memory of the lead exposure rats may be due to the decrease of the content of AVP and SS in hippocampus.
Key words：lead exposure；argipressin；somatotatin
流行病学调查［1］证实，铅暴露对儿童的智力和神经系统的发育造成严重损害，血铅浓度每上升10 μɡ/dl,将导致智商平均下降0.25点。经过多年的研究发现，铅的神经毒性已毋庸置疑，但其神经毒作用的机制至今尚未完全清楚。为此，本研究制作慢性铅暴露动物模型，采用免疫组化测定大鼠海马精氨酸加压素（AVP）和细胞生长抑素（SS），观察铅暴露对其阳性表达的影响，试图从分子水平为铅的神经毒作用机制提供一些依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 动物与分组 健康两月龄SD大鼠60只，由华中科技大学同济医学院实验动物学部提供，质量（120±20）g，雌雄不限。随机分为两组：染铅组及对照组，每组30只。
1.1.2 主要试剂与仪器 兔抗大鼠AVP多克隆抗体为丹麦DAKO公司产品，兔抗大鼠SS多克隆抗体购自武汉博士德公司，兔SP试剂(二抗)购于北京中山公司。CHYZFGS显微镜为日本Olympus公司产品；YBL2生物组织包埋机、HM315组织切片机分别为瑞典Ohauscorporation公司和德国Walldorf公司生产；HMP100组织脱水机和YT6生物组织摊烤机均来自孝感亚光医用电子技术研究所。
1.2 方法
1.2.1 动物模型制作 染铅组大鼠饮用0.1%醋酸铅去离子水3个月，制成慢性染铅大鼠模型；对照组仅饮用去离子水。
1.2.2 Y迷宫试验 两组大鼠分别于动物模型建成后第2 d置于Y迷宫中，整个试验规定仔鼠受电击后从起始臂直接逃至安全臂为“正确反应”，先进入通电臂则为“错误反应”，并记录为1次错误。以动物错误的次数(TE)作为评价仔鼠学习记忆能力的指标。通电给予足部最小电刺激，初始刺激电压为15 V，如果没有反应，以5 V为间隔单位上调刺激强度直至仔鼠有反应。每天上午10∶00时、下午15∶00时分别进行20次测试。
1.2.3 免疫组化切片的制作 （1）取材：两组大鼠经10%水合氯醛0.35 ml/100 mg腹腔注射麻醉后，开胸，左心室插入灌注针，剪破右心耳，快速依次灌注生理盐水100～150 ml，4℃的4%多聚甲醛250 ml，于30～40 min灌毕。断头，取小脑幕以上大脑半球，置于4℃的4%多聚甲醛固定液中，固定7～9 h，移入20%蔗糖溶液浸泡12 h以上，切片备用。（2）免疫组化染色： ①组织切片脱蜡，乙醇梯度脱水;②磷酸缓冲液（PBS）清洗，每次5 min×3次;③3%正常羊血清封闭30 min，消除内源性过氧化物酶;④10%生物素化羊抗兔IgG 37℃孵育30 min， 随机分为两组，分别滴加不同的特异性一抗，4℃过夜;⑤滴加1∶100稀释的生物素化二抗， 37℃孵育30 min。完成上述③④⑤程序后均重复②;⑥滴加过氧化物酶标记的链霉亲和素, 37℃孵育30 min;⑦二氨基联苯胺（DAB）显色10 min。封片。
1.2.4 统计学方法 数据以均数±标准差(±s)表示，采用Sigmastat软件进行分析，组间比较用t检验，多组间比较采用单因素方差分析及Dunnetts t检验。
2 结 果
2.1 Y迷宫试验结果 染铅组大鼠Y迷宫错误次数（18.4±1.2）明显高于对照组（12.7±1.4），差异有统计学意义（P<0.01）。
2.2 染铅组、对照组大鼠海马CA1、CA3区AVP和SS阳性神经元数比较 见表1。与对照组相比，染铅组在CA1 和CA3区AVP阳性神经元数均明显减少，差异有统计学意义(均P<0.01)；在CA1 区，染铅组与对照组比较SS阳性神经元数明显减少(P<0.05)，CA3区SS阳性神经元数量亦减少，但与对照组差异无统计学意义。 表1 染铅组及对照组大鼠海马CA1、CA3区AVP、SS阳性神经元数的比较注：与对照组比较*P<0.01,△P<0.05
2.3 染铅组与对照组大鼠海马CA1、CA3区AVP、SS阳性神经元形态比较 见图1、2。染铅组大鼠海马
图1 海马AVP阳性神经元形态 A:对照组海马神经元排列致密，大小一致，核清晰，细胞内棕色阳性物质均匀；B：染铅组海马神经元形态不规则，排列松散，胞浆内空泡变，核浅染，蓝色为核，棕色阳性物质色淡，阳性细胞数少（免疫组化染色×40） 图2 海马SS阳性神经元形态A：对照组海马神经元排列致密，大小一致，细胞内棕色阳性物质着色较深；B：染铅组海马神经元形态不规则，排列松散，胞浆内空泡变，棕色阳性物质色淡（免疫组化染色×40）
神经元(图1B)与对照组大鼠海马神经元（图1A）比较，形态变得不规则，排列松散，AVP阳性物质着色淡；SS阳性物质在染铅组（图2B）也较正常组（图2A）明显减少。
3 讨 论
铅暴露是全球普遍关注的公共健康问题［2］。许多动物研究［3］证实慢性铅暴露可引起婴儿期、幼儿期、儿童期、成年期持续性的认知功能和行为改变，而铅对学习记忆的影响尤其具有不可逆性［4］。本实验通过给大鼠饮用铅污染水使其暴露在低水平（0.1%）铅环境下3个月，结果发现染铅组大鼠学习记忆能力较对照组明显减低(P<0.01)，杨新华等［5］用水迷宫测试的结果也证明了铅暴露影响动物的学习记忆能力。
目前，世界各国对铅暴露影响学习记忆机制的研究十分广泛。诸如铅可以引发神经细胞凋亡，影响神经元突触形成［6］；使神经系统氧化抗氧化机制失衡，以致生物大分子被氧化破坏；阻断钙通道，抑制神经元递质的释放，干扰与钙有关的多种蛋白酶的活性，影响神经传导［7］；抑制与学习记忆密切相关的海马神经元长时程增强（LTP）［8］，导致学习记忆能力的减退。分子水平的研究发现AVP亦参与海马学习记忆过程。AVP是一个含二硫链环的九肽，来源于室旁核和视交叉上核,经穹窿投射于背侧海马和经海马伞至腹侧海马的AVP纤维均构成突触前成分,支持海马是AVP行为作用的重要部位的观点。为此，本研究通过采用免疫组化的方法观察铅暴露大鼠海马CA1 和CA3区AVP阳性神经元，发现染铅组AVP阳性神经元数较对照组明显减少(均P<0.01)，而且海马CA1 、CA3区细胞形态变得不规则，排列松散，阳性物质着色淡。另外一种与学习记忆密切相关的物质即SS，是一种14氨基肽，广泛存在于大脑皮质及边缘系统和周围神经中,尤其以丘脑及海马中含量最高［9，10］。SS的缺陷可为认知行为障碍的程度提供可靠的依据，海马内注射SS能够提高小鼠的空间学习能力［11］，而使用半胱胺耗竭大脑中SS，则使大鼠记忆明显受损［12］。本实验同样发现染铅组大鼠海马CA1 区中SS阳性细胞较对照组明显减少（P<0.05），而CA3区对铅损害不太敏感。由此可见，染铅动物学习记忆能力降低，与海马神经元AVP和SS含量减低直接相关。由于铅对智力的损害为不可逆性，这两种物质的减少是否会持续存在，或由于代偿会有所恢复，有待延长实验时间进一步验证。
综上所述，通过观察染铅大鼠海马CA1 和CA3区AVP、SS阳性物质的减少，从而提示铅暴露大鼠学习记忆能力的减低可能与此有关。但由于铅的神经毒理不具备特异性，要真正阐明铅的神经毒作用机制尚须进一步研究。
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