【关键词】铅；膜片钳；激光共聚焦；细胞内游离钙；电压依赖性钙通道；三叉神经细胞

Effect of Lead on intracellular free calcium and on voltage-dependent calcium channel in rat trigeminal nerve cells

MEI Yong, SUN Jing-zhi, YIN Xiao, GUO Xiang, WANG Zheng-lun, YANG Lei

（Department of Occupational and Environmental Health, School of Public Health, Tongji Medical College,Huazhong University of Science & Technology; Wuhan 430030 China）

 [Abstract] Objective To investigate the Effects of Lead on intracellular free calcium and on voltage-dependent calcium channel in rat trigeminal nerve cells. To explore the toxicity mechanism of lead in rat trigeminal nerve cells. Methods  whole cell patch-clamp technique was used to determine I_Ca of voltage-dependent calcium channel in the trigeminal nerve cells. Intracellular free calcium was measured to explore [Ca²⁺]_i dynamic changes from a single cell level by laser scanning confocal microscopy and fluorescence probe technique. Results  Lead resulted in increase of intracellular free calcium concentration in trigeminal nerve cells. Also, lead inhibited voltage-dependent calcium channel currents I_Ca in trigeminal nerve cells. Conclusion The effect that the increase of intracellular free calcium concentration in trigeminal nerve cells induced by lead was related to the release of intracellular calcium stores. And the voltage-dependent calcium channel I_Ca inhibited by lead was dependent on high-voltage-activated (HVA) calcium channels.

 [Key words]  Lead; Patch clamp; Laser scanning confocal microscopy; Intracellular free calcium; Voltage-dependent calcium channel; Trigeminal nerve cells

铅是一种典型的职业毒物, 铅作业可接触铅烟、铅尘或铅蒸气，铅作用于全身多个系统和器官，主要累及造血系统、神经系统。铅最强的有害作用就是其神经毒性,发育中的大脑对铅的神经毒性作用极其敏感，可造成不可逆性脑损害，这种损害将是长期甚至是终生的。人们已从分子、细胞、形态和功能上广泛研究了铅的神经毒作用机理，但仍未完全阐明其机制^[1]。神经细胞胞内游离Ca²⁺ 水平的异常持续增高可引起神经细胞损伤, 甚至死亡。三叉神经（trigeminal nerve）为混合性神经，含有躯体感觉和运动两种纤维，是神经细胞的代表，培养的三叉神经细胞仍保持着在体时的多种特性，本研究选用三叉神经细胞作为实验对象,用全细胞膜片钳方法检测铅对三叉神经细胞电压依赖性钙通道的影响，并用激光共聚焦（Laser Scanning Confocal Microscopy，LSCM）和FLUO-3/AM荧光探针标记技术，从单个细胞水平检测铅对胞内游离Ca²⁺ 瞬间动态变化的影响，以探讨铅对三叉神经细胞毒性作用的机制。

1 材料与方法

1.1试剂和仪器 

本实验所用的Fluo-3/AM、F-127、HEPES、TEA-Cl、EGTA、Choline-CL、CsOH、CsCL、CsF、Mg-ATP、poly-D-lysine、nifedipine等化学药品购自Sigma公司，胰蛋白酶、B-27 Supplement、DMEM/F12、胎牛血清购自GIBICO公司，醋酸铅等其余药品均为国产分析纯。Olympus FV500 激光共聚焦显微成像系统，膜片钳(Axopatch 200B, Axon instruments, Inc. USA),  SigmaPlot (SPSS, Chicago IL), 模数转换器( 1322A , Axon instruments, Inc. USA), 微电极拉制仪(German), 倒置显微镜(OLYMPUS, Japan), CO₂培养箱(Forma, USA),

1.2 方法

1.2.1 三叉神经细胞培养

动物 Sprague-Dawly(SD)大鼠，150－250g，由华中科技大学同济医学院实验动物心提供(证书编号19-020)。经戊巴比妥钠麻醉后股动脉放血处死，取出三叉神经节后剪成碎片，放置于含有1 % collagenase XI-SDMEM/F12含10%胎牛血清)培养液中。在37℃、C0₂培养箱内消化25 - 45 min后，用抛光的玻璃管将细胞打散，在培养液中加入10 μg/mL DNase I，继续消化10 min。将细胞冲洗3次，接于多聚赖氨酸处理过的盖玻片上，在37℃,5% C0₂培养箱内培养12一24 h，备用。

1.2.2  加药系统 

给药通过自制的六进一快速换液装置进行，给药出口管内径/外径：110μm/610μm，管口距所记录的细胞约为50-100μm。药物在持续正压作用下从加药管中流至细胞周围，通过Burleigh微操纵器移动加药管，实现瞬间达到所需药物浓度，并用持续负压吸引维持细胞池液面稳定。

1.2.3  激光共聚焦测定细胞内游离[Ca²⁺]_i

将自制培养皿中的三叉神经细胞用DMEM/F12漂洗，加入终浓度5μmol/L的Fluo-3/AM 和0.02% (w /v) pluronic F-127(Sigma 公司)，培养箱中37℃避光孵育30 min。孵育后，用正常脑脊液 (ACSF，mmol/L：125 NaCl， 2.5 KCl， 1 MgCl₂， 1.25 KH₂PO₄， 26 NaHCO₃， 2 CaCl₂ and 25 D-glucose)漂洗细胞以去除细胞外剩余的Fluo-3/AM备用。

将自制培养皿置入LSCM的测定小室内，在Olympus倒置显微镜下选择细胞。用488 nm激发波长在静息状态下预扫描5 min，待基线平稳，有稳定荧光值基础值后，继续扫描时快速细胞旁给药，给药后继续扫描5 min。观察加药前后细胞的荧光值变化，得出细胞XY平面内平均荧光强度，取多次照射的平均荧光强度，以平均荧光强度代表[Ca²⁺]_i 。

1.2.4  采用全细胞膜片钳技术记录钙电流I_Ca

钳制电压为-40 mV，刺激电压从-30 mV起至60 mV，阶跃10 mV，记录L型和N型高阈值钙通道电流。电流经Axopatch-200B放大，再经Digidata 1322A converter 数字化转换。信号采集率为10 kHz，经四阶贝塞耳低通滤波器过滤。电容和串联阻抗补偿率为60-70%。形成高阻抗封接（Giga seal）后，快电容补偿，破膜、行慢电容和串联电阻补偿。最后，输入参数并记录相应电流。实验在室温(20±2℃)下进行。运用pCLAMP 9.0 软件进行数据采集和资料分析。

2   结果

2.1 铅对三叉神经细胞[Ca²⁺ ]_i 的影响

三叉神经细胞负载Fluo-3/AM后，观察细胞内游离Ca^2＋图像，比较加Pb²⁺前、后细胞的平均荧光强度值变化，结果见表1。

表1　 Pb²⁺对三叉神经细胞[Ca²⁺ ]_i 的影响   (平均荧光强度值， ± S，n=6)

注：与对照组比较，* P < 0.05, ** P < 0.01

结果显示，在同一孵育时间胞内[Ca²⁺]_i随Pb²⁺剂量增加而增加，铅对三叉神经细胞[Ca²⁺ ]_i 的影响在0.01～1.0μmol/L范围内呈现剂量依赖关系。0.01、0.1、1.0μmol/L Pb²⁺可使三叉神经细胞的平均荧光强度值即时增加38.9%，143.2%和182.2%，亦即细胞内[Ca²⁺]_i分别增加38.9%，143.2%和182.2%。当胞外Ca²⁺ 浓度为2 mmol/L 时, 三叉神经细胞未受到刺激时，Fluo-3/AM荧光强度不变，细胞内的Ca²⁺稳定。

用0.1μmol/L Pb²⁺处理细胞后, 三叉神经细胞Fluo-3/AM的荧光强度在1到5 sec内升高143.2%。预先用nifedipine 10 μmol/l 处理细胞10 min，加0.1μmol/LPb²⁺处理后，预处理组平均荧光强度值只增加43.30%，nifedipine可在一定程度上减弱Pb²⁺的升钙作用并延缓Pb²⁺升钙的时间，10 μmol/l nifedipine 可显著性减少Pb²⁺的升钙作用。

2.2 铅对三叉神经细胞电压依赖性钙通道的影响

激光共聚焦实验发现Pb²⁺的升钙作用在时间和效应上可被电压依赖性钙通道拮抗剂nifedipine部分减弱，提示Pb²⁺的升钙作用可能与三叉神经细胞的电压依赖性钙通道有关。再利用全细胞膜片钳技术观察Pb²⁺对培养的大鼠三叉神经细胞I_Ca的影响，结果见表2。

表2　 Pb²⁺对三叉神经细胞电压依赖性钙通道I_Ca的影响   (I_Ca峰值， ± S，n=6)

注：与对照组比较，* P < 0.05, ** P < 0.01

结果显示，Pb²⁺在0.01～1.0μmol/L范围内剂量依赖性地抑制培养的三叉神经细胞I_Ca电流，给药5min之内抑制作用即可达最大效应。0.01、0.10、1.0μmol/L Pb²⁺可使三叉神经细胞I_Ca电流幅值分别减少（13.8 ± 2.3）%，（29.6 ± 5.2）%和（83.4 ± 7.06）%，差异有显著意义，Pb²⁺对三叉神经细胞电压依赖性钙通道有明显抑制作用。用Hill方程拟合：电流抑制率（％）＝E_max/[1+(IC₅₀/C)ⁿ]，得出其IC₅₀为0.78μmol/L，Hill系数n为0.78。如图1所示，0.10μmol/L Pb²⁺使I_Ca由给药前的4582.6pA减少至给药后的3289.4pA,给予正常细胞外液冲洗5min后，可见电流部分恢复，I_Ca恢复到3564.9pA（图1）。                          

图1.  Pb²⁺ 对三叉神经细胞电压依赖性钙通道I_Ca的影响

A. 对照组：I_Ca峰值,-4582.6pA；

B. 0.10μmol/L Pb²⁺灌流，I_Ca峰值,-3289.4pA；

C..经细胞外液冲洗5min后，可见部分恢复，I_Ca峰值,-3564.9pA.

3   讨论

电压依赖性钙通道分为L、N、T、P、Q、R6种亚型，L、N电压依赖性钙通道称为高电压激活钙通道，常分布于神经细胞膜表面。神经元中主要有两种离子通道允许Ca²⁺内流:电压激活钙通道的和NMDA激活的通道。Pb²⁺减小电压激活的钙通道，也减小NMDA激活的钙电流，对两者的作用都是特异的^[2-4]。Pb ²⁺主要抑制电压敏感性钙通道的离子流，是各种脊椎动物和非脊椎动物神经元电压门控钙通道的强阻断剂，包括对海马神经元、背根神经节神经元^[5]。Pb²⁺对钙电流的阻断效应是高度电压依赖性的，并随去极化而加强，这与和Ca²⁺离子竟争钙通道的同一结合位点有关。铅通过竞争作用影响Ca²⁺对神经细胞的调节作用，与Ca²⁺有一个高度特异性的竞争位点， Pb²⁺对神经传递的作用可能与特异性位点有关。也有研究结果证明^[6,7]，铅是大鼠背根神经节神经元、海马细胞钙通道的强的、可逆的阻断剂，铅至少与钙通道上两个Ca²⁺位点有高度结合力，而且减少了Ca²⁺进入细胞的数目，证实了低浓度Pb ²⁺通过背根神经节神经元、海马细胞上的电压依赖性钙通道抑制Ca²⁺内流。

钙作为重要的细胞内第二信使，参与多种生理和病理代谢过程，因此细胞内钙反应曲线的测量一直以来受到高度重视。然而，由于正常静息细胞内[Ca²⁺]_i低于结合钙2×10⁴倍，如此微量的游离钙不仅使测量十分困难，而且细胞内[Ca²⁺]_i变化过程仅在400毫秒内完成，这种瞬态变化是常规扫描系统不易观察到的。本研究应用细胞旁快速给药系统，使被检测细胞瞬间达到有效药物浓度，利用激光共聚焦扫描和全细胞膜片钳技术相结合，观察Pb²⁺对培养的大鼠三叉神经细胞的影响。

研究发现Pb²⁺在0.01～1.0 μmol/l范围内迅速升高三叉神经细胞[Ca²⁺]_i，升高作用随浓度增加而加强，并且这种升高作用可被电压依赖性钙通道的拮抗剂nifedipine部分减弱，揭示Pb²⁺的升钙作用与三叉神经细胞电压依赖性钙通道相关。激光共聚焦实验结果提示Pb²⁺的升钙作用与电压依赖性钙通道有关，因此利用全细胞膜片钳技术研究Pb²⁺对电压依赖性钙通道的作用，结果显示Pb²⁺在0.01～1.0μmol/l范围内剂量依赖性降低I_Ca幅值，抑制钙内流。

全细胞膜片钳实验证明三叉神经细胞内[Ca²⁺]_i的增加不是通过膜上电压依赖性钙通道进入胞内的，那么细胞内增加的[Ca²⁺]_i 会从哪里来？结合膜片钳和激光共聚焦实验结果及相关文献报道^[8，9]，我们推测Pb²⁺对培养的SD大鼠三叉神经细胞[Ca²⁺]_i的增加与电压门控钙通道、受体门控钙通道和钙库控制的钙通道相关。Pb ²⁺可能破坏神经细胞中钙信号传递，作用于线粒体，破坏内质网上的第二信使三磷酸肌醇(IP₃)，促使胞内钙库释放钙，使细胞内游离的Ca²⁺浓度升高，胞内Ca²⁺超载是神经细胞损伤死亡的重要原因。本实验条件下Pb²⁺可能通过使膜电位去极化以及降低跨膜离子梯度,导致依赖此种梯度的转运过程受到抑制，改变膜的通透性及膜上电压依赖性钙通道的功能，而电压依赖性钙通道功能的改变直接或间接地影响了胞外钙离子内流，Pb ²⁺对钙通道的调控，神经元中钙自身稳定的调节发生变化，也可能促使三叉神经细胞胞内钙库释放，细胞内游离钙离子浓度增加。

 

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